Raccomandazioni 2018 per l’esecuzione di test molecolari su biopsia liquida in oncologia.

AIOM, SIGU, SIBIOC, SIAPEC-IAP
Nuove raccomandazioni 2018

Con il termine di biopsia liquida si fa riferimento all’utilizzo di fluidi biologici come surrogato del tessuto neoplastico per ottenere informazioni utili ai fini diagnostici, prognostici o per predire la risposta alla terapia.

L’analisi del DNA tumorale circolante (circulating tumor DNA, ctDNA) contenuto nel DNA libero circolante (cell free DNA, cfDNA) che può essere isolato dal sangue periferico, rappresenta a oggi il principale approccio di biopsia liquida impiegato nella pratica clinica.

La determinazione dello stato mutazionale del gene EGFR su campione tissutale/citologico ottenuto mediante biopsia o intervento chirurgico al momento della diagnosi è attualmente raccomandata in tutti i pazienti con NSCLC, stadio IIIB-C e IV.
Tuttavia, circa il 25% delle biopsie polmonari standard non riesce a fornire una quantità/qualità di materiale adeguato all’analisi molecolare.
La valutazione dello stato mutazionale del gene EGFR su biopsia liquida è attualmente raccomandata come alternativa all’analisi su tessuto tumorale nei pazienti con nuova diagnosi di NSCLC avanzato, in cui la quantità e/o qualità del tessuto disponibile non siano sufficienti per effettuare le analisi molecolari previste.

La rivalutazione dello stato mutazionale del gene EGFR al momento della progressione radiologica dopo trattamento con un EGFR-TKI è importante per definire la migliore strategia terapeutica.
Il test T790M mediante biopsia liquida è attualmente impiegato come primo approccio diagnostico in tutti i pazienti con NSCLC avanzato EGFR M+ in progressione, dopo trattamento con EGFR-TKI.
La sovrapponibilità del test eseguito su biopsia liquida o su tessuto è stata dimostrata nello studio AURA, confermando quindi la possibilità di utilizzo del test su ctDNA.

Mutazione EGFR sensibilizzante
T790M
Interpretazione
+
+
T790M positivo
+
T790M negativo. La biopsia tissutale è raccomandata
+
T790M positivo. L’analisi deve essere ripetuta per escludere possibili falsi positivi
Campione non informativo. I livelli di ctDNA sono troppo bassi. Ripetere il prelievo o procedere alla biopsia tissutale
Elaborazione grafica da Tab. 1, Rif. AIOM, SIGU, SIBIOC, SIAPEC-IAP – Nuove raccomandazioni 2018

Gestione dei “falsi negativi”

Tutti i pazienti nei quali l’analisi mutazionale su ctDNA risulti “negativa” devono essere sottoposti ad analisi su tessuto tumorale.
Prima di procedere alla biopsia tissutale, si può prendere in considerazione la ripetizione della biopsia liquida.
Per incrementare le possibilità di successo della biopsia liquida, il test dovrebbe essere eseguito al momento dell’evidente progressione di malattia.
Per una corretta interpretazione del test, deve essere eseguita la valutazione della mutazione sensibilizzante di origine.
In caso di assenza di tale mutazione, il test dovrà essere considerato non informativo in quanto il prelievo non contiene quantità sufficienti di ctDNA.

Dal prelievo di sangue alla refertazione

Dal prelievo di sangue al cfDNA: che cosa sapere
La quantità di DNA che è possibile estrarre dal sangue periferico è molto limitata (pochi ng/ml).
Il prelievo può essere raccolto in tubi standard oppure in tubi contenenti speciali fissativi in grado di stabilizzare il cfDNA.
Il cfDNA ha una breve emivita, circa 2,5 ore.

Il sangue raccolto può essere conservato prima dell’isolamento del plasma per un massimo di 3 ore a temperatura ambiente.
Il plasma deve essere isolato mediante centrifugazione.

  • Una prima centrifugazione a bassa velocità (1200-1600 giri) per evitare la lisi dei leucociti
  • Una successiva centrifugazione del sopranatante a elevata velocità (≥3000 giri) per rimuovere tutti i contaminanti.
Il plasma ottenuto può essere conservato a:

  • –20 °C per brevi periodi (~1 mese)
  • –80 °C per periodi più prolungati
La qualità del campione può essere compromessa dall’emolisi durante la flebotomia.
La conservazione del sangue a 4 °C non previene la lisi dei leucociti.

Metodiche disponibili per lo studio delle mutazioni del ctDNA
Gold Standard: Real Time PCR (RT-PCR)
L’analisi di mutazioni puntiformi o di piccole inserzioni/delezioni su ctDNA può essere condotta tramite utilizzo di tecnologie di RT-PCR.
Limite di rilevazione: ≤0,5%
A supporto del Gold Standard:

Digital PCR

  • Droplet digital PCR (ddPCR)

  • BEAMing (Beads, Emulsion, Amplification, Magnetics) dPCR
Sensibilità: 0,1%
Specificità: 0,01%
Tecniche di sequenziamento:

  • Next Generation Sequencing (NGS)
 

Refertazione
La refertazione è parte della procedura diagnostica e dovrebbe contenere le seguenti informazioni:
La refertazione non deve superare i 5 giorni lavorativi dalla richiesta della determinazione


Elaborazione grafica da Tab. 1, Rif. AIOM, SIGU, SIBIOC, SIAPEC-IAP – Nuove raccomandazioni 2018
BIBLIOGRAFIA: Raccomandazioni per l’esecuzione di test molecolari su biopsia liquida in oncologia. A cura del gruppo di lavoro AIOM-SIAPEC-IAP-SIF-SIBioC. Luglio 2018

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