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Sviluppo di un pannello genetico per il next-generation sequencing (NGS) delle mutazioni clinicamente rilevanti nel DNA libero circolante (cfDNA) di pazienti affetti da patologie tumorali

La medicina di precisione, basata sulla valutazione dei biomarkers tissutali predittivi di risposta al trattamento, ha trasformato la pratica clinica.
Il test per la mutazione di EGFR nel carcinoma polmonare non a piccole cellule (NSCLC) e di altre mutazioni in altri tipi di tumore ha consentito di aggiungere un valutazione genotipica alla diagnostica dei tumori solidi. Tuttavia, il tessuto tumorale non sempre è disponibile o sufficiente per effettuare il test molecolare, specialmente se il tumore è diagnosticato in stadio avanzato su piccoli campioni bioptici. In altri casi, a causa della localizzazione o della ridotta dimensione del tumore, potrebbe risultare difficoltoso o rischioso prelevare un campione di tessuto, in modo particolare nei pazienti trattati estensivamente. Alcuni biomarkers predittivi possono essere analizzati in maniera non invasiva nel cfDNA (DNA libero circolante), offrendo un’alternativa al prelievo di un campione tissutale. La performance del test sul cfDNA può essere migliorata con l’utilizzo del NGS, che può lavorare su diversi geni per identificare anche le varianti nuove e quelle meno comuni.
La strategia nota con il nome di ultra-deep sequencing (basata sull’utilizzo di piccoli pannelli di NGS mirata ad analizzare un numero limitato di geni) può incrementare notevolmente la sensibilità del test; la specificità è essenziale considerato che il ctDNA (DNA tumorale circolante) rappresenta solo una piccola porzione (<0,5%) del cfDNA totale nella maggior parte dei pazienti con tumori solidi.
In questo studio proof-of-concept, Malapelle e colleghi presentano lo sviluppo, la valutazione della performance e l’implementazione nella pratica clinica di un ristretto pannello genico in grado di identificare 568 mutazioni clinicamente rilevanti all’interno di sei geni (EGFR, KRAS, NRAS, BRAF, cKIT e PDGFRα), implicate rispettivamente nell’insorgenza di carcinoma polmonare non a piccole cellule (NSCLC), tumore stromale gastroIntestinale, tumore metastatico del colon-Retto e mElanoma (l’acronimo del pannello è SiRe). Questo pannello è caratterizzato da sensibilità e specificità elevate, che consentono l’identificazione e la quantificazione delle mutazioni nel cfDNA purificato da campioni di plasma e siero prelevati da pazienti con differenti tumori solidi.

 

MATERIALI e METODI

Utilizzando il Taqman-derived assay (TDA), Malapelle e colleghi hanno identificato preventivamente la mutazione di EGFR nel NSCLC con una specificità del 100% e una sensibilità del 69% e hanno poi valutato la performance del pannello in tre fasi:

  1. Analisi della sensibilità analitica sul DNA di due linee cellulari, utilizzando uno standard di riferimento artificiale con mutazioni multiple in geni differenti;
  2. Analisi del cfDNA in pazienti con carcinoma alla diagnosi (n=42), in fase di risposta al trattamento (n=12) e in fase di progressione tumorale (n=11);
  3. Analisi dei campioni di sangue prospetticamente raccolti dai pazienti con NSCLC (n=79).

RISULTATI:

Il pannello genetico SiRe ha dimostrato di possedere un’elevata performance analitica e un limite di rilevabilità pari a 0,01%. Nelle serie retrospettive, SiRe ha identificato 40 mutazioni di EGFR, 11 mutazioni di KRAS, 1 mutazione di NRAS e 5 mutazioni di BRAF (96,8% di concordanza con TDA). Nei campioni al basale, SiRe ha dimostrato una specificità del 100% e una sensibilità del 79% relativamente al campione tumorale tissutale. Infine, nelle serie prospettiche, SiRe ha identificato 8,7% (4/46) mutazioni di EGFR al basale e 42,9% (9/21) mutazioni di EGFR T790M nei pazienti in progressione.

DISCUSSIONE:

L'ultra deep sequencing, che utilizza un pannello NGS ristretto, ha fornito risultati eccellenti. Questa procedura può essere utilizzata per effettuare test di routine per mutazioni tumorali rilevanti su cfDNA. L’elevata sensibilità (90,5%) e la specificità analitica (100%) di questo pannello sono equivalenti o addirittura superiori rispetto ad altre procedure di questo genere, come i metodi basati sulla real-time PCR.
Con la procedura proposta in questo studio possono essere processate simultaneamente diverse tipologie di campioni (DNA da tessuto tumorale e cfDNA da fluidi biologici) provenienti da pazienti con malattie differenti (es: NSCLC, tumore stromale gastrointestinale, tumore metastatico del colon-retto e melanoma). In questo modo, il turnaround time (TAT) può essere ridotto a tre giorni, come raccomandato dalle linee guida internazionali.

Grazie all’elevata sensibilità di questo saggio, il tasso di mutazioni di EGFR identificato dagli Autori nei pazienti con NSCLC su cfDNA al basale risulta in linea con i dati precedentemente ottenuti dall’analisi di campioni tissutali. Restringendo il campo alla mutazione di EGFR, il deep sequencing ha raggiunto il 61-80% di sensibilità e il 94-98% di specificità nel NSCLC avanzato. Il pannello SiRe è quindi in grado di identificare anche la comparsa di mutazioni di resistenza quali EGFR T790M.

CONCLUSIONI:

Malapelle e colleghi hanno sviluppato e traslato nella pratica clinica un saggio NGS basato su un ristretto pannello genico. Tale saggio è in grado di identificare mutazioni rilevanti nel cfDNA purificato da campioni di plasma e siero prelevati da pazienti con i tumori più comunemente sottoposti a test per la ricerca di alterazioni molecolari (come NSCLC, tumore metastatico del colon-retto e melanoma metastatico). Il pannello SiRe ha sensibilità e specificità eccellenti ed è quindi un valido approccio per effettuare test su campioni di sangue nella pratica clinica. Infine, questo metodo permette l’applicazione del NGS su basi prospettiche nella routine della valutazione dei biomarkers quali marcatori predittivi di risposta, in modo particolare quando il tessuto tumorale non è disponibile, ed è uno strumento utile a monitorare il corso della malattia.

BIBLIOGRAFIA:

Malapelle U et al. Development of a gene panel for next-generation sequencing of clinically relevant mutations in cell-free DNA from cancer patients. Br J Cancer. 2017;116(6):802-810. doi: 10.1038/bjc.2017.8

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